Tecnicas de Manipulação Genética

Técnicas de Manipulação genética

A engenharia genética permite manipular directamente genes de determinados organismos, possibilitando isolar e transferir genes responsáveis pela produção de certas substâncias, para outros seres vivos que não produzam essas substâncias, de modo a serem funcionais nesses seres.

DNA Recombinante

A técnica de DNA recombinante permite juntar na mesma molécula de DNA genes provenientes de organismos diferentes, ou seja, possibilita retirar genes de uma espécie e introduzir num microrganismo, que posteriormente se vai multiplicar e assim produzir inúmeras copias desse gene e consequentemente o produto desse gene. É possível, por exemplo, introduzir um gene humano, numa bactéria, para que elas produzam uma determinada proteína humana.

O processo é simples e baseia-se em dois tipos de enzimas, as enzimas de restrição e a enzima DNA ligase. Utiliza-se uma enzima de restrição, que tem a capacidade de seleccionar zonas especificas do DNA e cortar a sequencia nucleotídica nesses locais específicos, para obter o gene de interesse de uma espécie. Esse gene de interesse é posteriormente colocado num vector, ou seja, uma molécula capaz de transportar um fragmento de DNA de um organismo para outro, como são exemplos, o DNA dos virus e os Plasmídeos (fragmentos de DNA de forma circular existentes nas bactérias). Para que o fragmento de DNA seja incorporado no vector, é necessário que a mesma enzima de restrição que actua sobre o DNA actue sobre o vector, de modo a criar uma sequencia nucleotídica complementar. Finalmente, através da enzima DNA ligase, os dois segmentos de DNA são ligados, produzindo uma nova molécula estável – o DNA recombinante. Com a nova molécula de DNA recombinante formada, o vector é introduzido num organismo receptor, que vai passar a possuir aquele gene de interesse e a proteína formada por esse gene.

DNA complementar

A técnica do DNA complementar tem como objectivo facilitar a produção de proteínas de seres eucariontes em microrganismos. Os microrganismos não têm mecanismos de maturação do mRNA, portanto quando se introduzem genes de eucariontes nestes organismos, estes vão fazer a sua transcrição de forma initerrupta, ou seja, vão ler tanto os intrões (zonas não codificantes de proteínas) como exões (zonas codificantes de proteínas) originando uma proteína diferente da pretendida.

O DNA complementar baseia-se então em produzir uma molécula de DNA constituída apenas por exoes de modo a que quando for transcrita pelo microrganismo pretendido, origine a proteína pretendida.

Este processo é possível devido á acção da enzima transcriptase reversa, que permite produzir DNA a partir de uma molécula de mRNA, e da enzima DNA polimerase, que permite fazer uma cadeia complementar de uma cadeia de DNA. Utiliza-se então a transcriptase reversa para fazer uma cópia de uma cadeia de mRNA maturado e originar uma cadeia de DNA composta apenas por exões.

Posteriormente usa-se a DNA polimerase para formar um cadeia complementar dessa cadeia de DNA, originando uma molécula estável. Com isto, ao ser introduzida num microrganismo, vai produzir uma proteína de interesse.

PCR (Reacção em Cadeia Polimerase)

A técnica de reacção em cadeia da polimerase (PCR) veio possibilitar novas estratégias de analises de genes no âmbito da tecnologia do DNA recombinante. De um modo geral, a tecnica PCR pode ser considerada como um meio de clonagem e baseia-se na ampliação do DNA, replicando-o. O processo resume-se em três fases.

A fase de desnaturação, onde o DNA é exposto a elevadas temperaturas, na ordem dos 95º, originado a separação das duas cadeias.

De seguida vem a fase Hibridização, onde as temperaturas descem até aos 55º e são colocados os primers (iniciadores). Isto são fragmentos de DNA que são ligados (hibridizados) no inicio de cada sequencia alvo, nas cadeias originadas na primeira fase por complementação de bases, para na terceira fase a enxima utilizada reconhecer uma cadeia dupla.

Numa terceira fase é utilizada a DNA polimerase que identifica a zona onde se localiza o primer e reconhece essa zona como dupla cadeia, e assim pode actuar, replicando o resto da cadeia de DNA, ou seja, fazendo a elongação dos primers.

Bombardeamento de partículas

Segundo o método de bombardeamento, micropartículas de um metal (tungstênio ou ouro) são revestidas por fragmentos de DNA contendo os genes selecionados. Através de um aparelho ("canhão de genes"), as partículas são aceleradas a altas velocidades e bombardeiam o tecido vegetal que vai sofrer a transformação. As partículas penetram nas células e libertam os fragmentos de DNA. As células da planta assimilam os genes e alguns passam a integrar o genoma.